PCR实验常见问答

　　Q-1:

　　LA PCR的反应条件?

　　A-1:

　　因扩增片段的大小、反应体积、使用扩增仪器的不同而不同。

　　◇ 循环次数

　　根据模板DNA的量以及扩增片段的大小，设定25 ~ 30个循环。

　　如果循环次数太少，扩增量不足;如果循环次数太多，则会出现Smear。

　　◇ Anneal以及Extension

　　合适的Anneal温度通常在45 ~ 68℃之间 (预备实验可2℃间隔进行)。另外，由于TaKaRa LA Taq 在60 ~ 68℃间也有很高的活性, 因此可在此温度范围内设定Anneal-Extension温度, 进行2 Step PCR。Anneal-Extension温度为68℃ 时，每kbp大体可设定30秒 ~ 1分钟;当温度设定在68℃以下时, 时间设定可稍长一些。通常，Anneal温度太高，有时会得不到扩增产物;Anneal温度太低时，容易发生非特异性反应。另外，Extension时间太短时，会得不到扩增产物或者会有一些短的非特异性产物优先生成;而Extension时间太长时，会出现Smear。

　　Q-2:

　　选择LA PCR引物 (Primer) 时的注意事项?

　　A-2:

　　特异性非常重要。20mer左右的Primer, 如果特异性高，扩增20 kbp没有问题，但如果可能的话，建议设计30 ~ 35mer左右。使用特异性低的Primer时，会出现很多非特异性产物。

　　Q-3:

　　LA PCR时酶的使用量?

　　A-3:

　　50 μl的反应体系可使用2.5 U的TaKaRa LA Taq。但合适的用量也与模板DNA的量及Complexity、扩增片段大小有关。酶量过多时，易发生非特异性反应，出现Smear;而酶量过少时，反应性能下降。

　　Q-4:

　　LA PCR时模板DNA的调制方法?

　　A-4:

　　模板DNA的质量是LA PCR成功与否的重要因素。扩增超过10 kbp的DNA片段时，用简单的方法 (例如Cell只经过加热处理或Protease处理) 调制的DNA作模板不太合适， 建议使用充分精制的完整的DNA (没有Nick等)。

　　Q-5:

　　是否可以对λ 噬菌体直接进行LA PCR反应?

　　A-5:

　　可以。99℃、10 min处理后的噬菌体约106 ~ 107 pfu作为模板，至少可扩增8 kbp的DNA片段。

　　Q-6:

　　对Mammalian cell或E. coli 只进行热处理 (98℃， 2 min) 或Protease处理的样品可否进行LA PCR?

　　A-6:

　　◇ 对E. coli只进行热处理可扩增10 kbp的DNA片段 (50 ml PCR反应液中37℃ Overnight culture in L-both 使用2 μl)。

　　◇ Human细胞 (培养细胞) 如只经过热处理，可扩增数百bp;经过Protease处理、 热处理后的样品，较多可扩增1 ~ 2 kbp。所以，如果要扩增长链DNA，建议使用经过充分精制的完整的DNA作模板。

　　Q-7:

　　使用LA Taq是否也产生A的Overhang? (PCR产物是否可直接克隆于T-vector中?)

　　A-7:

　　可以。使用TaKaRa LA Taq 及TaKaRa Ex Taq 时的PCR产物产生A的Overhang，与使用TaKaRa Taq 时的PCR产物克隆于T-vector 的效率基本相同。