原位杂交实验技术主要器材和实验步骤
原位杂交实验技术主要器材和实验步骤 | 时间: December-7 11:25:02 | 分类:技术栏目
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医用微波炉，恒温水浴箱、湿盒、PNP笔等。
三、试剂
试剂:
● 2.5ml/L 的醋酸--2.5ml/L醋酸酐:
三乙醇胺 13.2ml
氯化钠 5g
浓盐酸 4ml
醋酸酐（用前加） 2.5ml；
● 20×SSC（pH7.0）：
氯化钠 175.3g
枸橼酸钠 88.2g
双蒸水定容至1L；
● 100×Denhardt‘s:
Ficoll 1g
PVP 1g
BSA 1g
ddH2O 定容至50ml；
● 杂交液：（50ml） 用量 终浓度
100%去离子甲酰胺 25ml 50%
100%葡聚糖硫酸脂 5mg 10%
100×Denhard‘s 0.5ml 1
1Mtris-HCL（PH8.0） 0.5ml 10Mm
5M NaCl 3ml 0.3M
0.5M EDTA （PH8.0） 0.1ml 1mM
10mg/ml 变性鱼精DNA 0.5ml 100ug/ml
ddH2O定容至25ml
● 0.1M甘氨酸/PBS:
甘氨酸 7.5g
Na2HPO4 30.8g
NaH2PO4 2.8g
NaCl 8.5g
溶于800mlddH2O，定容至1000ml，高压，室温储存；
●TSM1 （1000ml）：
1MTris-HCL（PH8.0） 100ml
5M NaCl 20ml
1M MgCl2 10ml
ddH2O定容至1000ml；
●TSM2 （1000ml）：
1MTris-HCL（PH8.0） 100ml
5M NaCl 20ml
1M MgCl2 50ml
ddH2O定容至1000ml；
● 抗体稀释液： 100ml
BSA 1.0g
Tris X-100 0.4ml
叠氮钠 0.4g
0.05M PBS （PH7.2）调至100ml；
● 0.05M PBS （PH7.2）：1000ml
Na2HPO4 15.4g
NaH2PO4 1.4g
NaCl 4.25g
●去内源性酶液（40ml）：
储存液 用量 终浓度
10%甲醛 4.0ml 0.3—0.5%
冰醋酸 10.0ml 25.0%
加0.05MPBS至40ml
● 0.4% Triton-X 100
四、关于原位杂交实验技术操作步骤：
一质粒制备
1质粒的转化和扩增
1.1制备XL1-Blue感受态细菌
1． 取400uL XL1-Blue菌种加入到含200ml LB培养基的锥形瓶中，37 ℃、100 rpm培养4h，离心，倒置，以冰冷的0.1 mol／L
CaCl_2重悬细菌，冰浴30 min， 离心，弃上清，倒置，再加4ml(含15％甘油)冰冷的CaCl2重悬细菌，分装(200 μ／tube)，-80
℃保存。
2． 转化：在冰浴中将1管XL1-Blue感受态菌解冻，将浓度为2ng／μ1的质粒 DNA4μ1加入到8Oμ1感受态菌中。
3． 轻轻摇匀，冰浴30 min。
4．42 ℃热激9O秒，然后迅速冰浴2 min。
5． 加入LB培养液(无氨苄青霉素)0.8ml，在37 ℃，100转／min水浴孵育 60 min。
6．取200μl菌液铺于琼脂板上(涂有X-Gal(20mg／ml)-IPTG(200mg／ml)的 LB-氨苄青霉素50
mg／ml,1μl／ml培养基)，待菌液全部被吸收后，倒置平 板于37 ℃培养12-16h。
1.2鉴定和挑选含重组质粒的菌落
1． 用无菌牙签挑取单菌落，接种到10 ml含氨苄青霉素的LB培养液的离心管中，于37 ℃，200转／分培养2h，取1
ml之一Eppendorf离心管，加50μl 10mmol／L EDTA(pH 8.0)。
2． 加入50μl新配置的0.2mol／L NaOH、0.5％SDS、20％蔗糖溶液后，振荡3O秒。
3． 在70 ℃温育5 min，然后冷却到室温。
4． 加1.5μ14mol／L KCl和0.5μ1含0.4％溴酚兰染液，振荡3O秒后，冰浴5min。
5． 12000g，4 ℃离以 3 min，以除去细菌碎片。
6． 制备1％的琼脂糖凝胶(含EB0.5μg／ml)，取50μl上清液加入到样品孔中，其中一孔加入中等分子量DNA Marker。恒压50V，进行电泳。
7． 当溴酚兰迁移到凝胶全长的2／3-3／4时，停止电泳，在紫外灯下检查质粒DNA分于量的大小是否与转入质粒相符。
1.3质粒的扩增和纯化
1． 用无菌牙签分别挑取单个白色菌落移入含30ml LB-氨苄青霉素(50μg／ml)培养液的聚丙烯管中，于37 ℃，200转／分培养3h。
2． 将菌液转入含70 ml LB-氨苄青霉素培养液的250ml锥形瓶中，37 ℃，200转／分培养过夜(12-16h)，细菌浑浊。
3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，终浓度为170 μ／ml)。37 ℃，200转／分培养12-16h。
4. 将培养的细菌倒入50ml的离心管中，6000rpm，4 ℃离,th,15 min，沉淀细菌。
5. 弃净上清夜，用2ml预冷的溶液I，悬浮菌体沉淀，剧烈振荡，于室温静置5 min
6. 加入新配制的溶液II 4ml，快速用手晃动10秒，颠倒数次后，于室温静置10 min。
7. 加入预冷的溶液III 3ml，温和振荡l0秒，于冰上静置10 min，出现白色絮状沉淀。
8． 6000rpm，4 ℃离心15 min，保留上清。
9． 将上清(若带细菌残片，则再次离心)移入另一50ml的离心管中，加入O.6倍体积的异丙醇混匀，于室温静置10 min。(或-20 ℃4h，或4
℃过夜，可便核酸沉淀)
10.12000 rpm，4 ℃离心15 min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残 兼上清液流尽。
11．于室温用70％的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm离心，15 min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使较后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
12．用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，转移至1.5 ml Eppendorf管中。
13．加入用冰预冷的5mol／L的LiCl溶液600μl，充分混匀。12000 rpm，4 ℃离心15 min，以沉淀高分子量的RNA。
14.将上清转移到另一1.5 ml Eppendorf管中，加等量异丙醇，充分混匀，于室温静置10min。
15.12000 rpm,4 ℃离心15 min，回收核酸。小心弃去上清，倒置离心管使残余上清液流尽。
16．于室温用70％的乙醇洗涤沉淀物和管壁，室温12000 rpm离心，15 min，充分弃去乙醇，于室温将离心管倒置在纸巾上，使较后残余的痕量乙醇挥发殆尽。
17.400μl含无DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转移到另－1.5 ml
Eppendorf管中，室温放置1.5ml Eppendorf管中30min。
18．加入400μl 13％(v／v)的PEG 8000-NaCl(1.6 mol／L)，混匀，4 ℃ 12000 rpm离心5
min以回收质粒DNA，弃去上清。
19．加入400μl TE缓冲液(pH 8.O)溶解沉淀，再分别用等体积的Tris饱和酚、酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。
20．将水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中，加入O.1体积(约50μ13M 的醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积(大约1
ml)的无水乙醇，充分混匀后于4 ℃放置30 min。
21．于4 ℃ 12000 rpm离心5 min回收沉淀的质粒DNA。尽可能弃去上清，敞开管口，置工作台上使残留的痕量乙醇蒸发殆尽。
22．加入400 μl处于4 ℃的70％乙醇，稍加振荡，漂洗沉淀，4 ℃ 12000 rpm离心2 min。
23．吸去上清，室温敞开管口，直到乙醇完全挥发。
24．用100μl TE缓冲液(pH 8.0)溶解沉淀。
25．取4μl溶液1：100稀释后，测定其OD260、OD280，以确定质粒DNA的
纯度和浓度(OD260／OD280>1.8。OD260／OD280对DNA而言其值大约为1.8，高于2.0则可能有RNA污染，低于1.8则有蛋白质污染。；DNA浓度
=OD260 X 0.05 X稀释倍数(μg／μl)。
26．质粒DNA溶液于-20 ℃保存待用。
cRNA探针的标记
1． 将质粒DNA，用相应的限制性内切酶线性化，通过琼脂糖凝胶电泳以确保完全线性化。
2． 线性化后的DNA按“质粒的纯化”步骤19-24进行纯化，作为cRNA探针 标记的模板，用相应的RNA聚合酶合成地高辛标记的反义和正义RNA探 针。
3． 进行体外转录，步骤如下：
4． 在冰上将各试剂加入一1.5 ml无RNA酶的Eppendorf管中。
DEPC处理的三蒸水8μl
质粒DNA模板 0.05μg／μl 1μl
10 x NTP地高辛标记混合物 1 x 2μl
0.1 M DTT溶液 10 mM 2μl
5 x转录缓冲液 1 x 4μl
RNAse抑制剂 2U／μl 1μl
RNA聚合酶 2U/μl 2μl
反应体系总体积 20μl
5． 加入上述各试剂后，混匀，简短离心后在37 ℃孵育2h。
6． 加入2μl无RNA酶的DNA酶I(10U／μ1)，37 ℃孵育15 min降解模板DNA。
7． 加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2μl终止反应。
8． 加入2.5μl的4 M Licl和7.5μl冷的无水乙醇，混匀，-20 ℃放置2h。
9． 12000g下离以 15 min，弃上清，小心地用50 μl冷的70％乙醇洗涤沉淀。
1O．室温下稍干燥，溶于100μ1 DEPC处理过的三蒸水中，混匀分装，-20 ℃下保持备用。
冰冻切片与杂交前预处理：
1． 将样品从-80 ℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃(切片机腔体温度)平衡至少30
min。将包埋好的样品固定在样品头上，切10μm厚的连续组织切片，平铺于涂有多聚赖氨酸(1mg／m1)的玻片上(玻片预先经180 ℃干烤6小时)，保存于-70
℃冰柜备用。
2． 冰冻切片经室温干燥10 min后，在4％的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lOmin。
3． 活跃的DEPC-PBS(未高压的0.1％DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。
4． 在0.2M的盐酸作用中作用10 min后，重复步骤4)。
5． 在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg／m1)，37 ℃孵育15 min，重复步骤4)。
6． 经0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25％AA／0.1M TEA (乙酸酐／三乙醇胺，pH 8.0)中乙酰化10
min。(在大多数实验中，步骤4，5，6省略)
7． 5 x SSC中平衡15 min。
杂交：
（一） 脱蜡，水化：
1、 二甲苯10min 两次
2、 无水乙醇3min 两次
３、95%乙醇3min 一次
４、75%乙醇3min 一次
５、50%乙醇2min 一次
６、重蒸水2min 一次
７、PBS洗涤5min
（二）将组织芯片放入去内源性酶液中浸泡30min；PBS洗涤5min
（三）0.1M甘氨酸去游离醛基 15min；0.4%tritonX-100 洗10min；
（四）用蛋白酶K与37℃孵育30min ，PBS振洗5min
（五） 在0.1mol/L三乙醇胺——0.25%乙酸酐中孵育10min ;在2×SSC中洗5min ；
（六） 滴加预杂交液42℃,30min；将RNA探针用预杂交液稀释（1ng/ｕL~2ng/ｕL）
（七）杂交
１、在载玻片表面覆盖上杂交小室，加20~50ｕL的杂交液到组织芯片TMA上，42℃~44℃湿盒中过夜。
２、在4×SSC中37℃洗涤15min
３、2×SSC，加入RNA酶（大致为10ｕg/ml）37℃中洗涤30min，
４、0.5×SSC,37℃洗涤15min
（八）关于原位杂交实验技术封闭
１、1%正常山羊血清孵育30min
２、用抗体稀释液稀释碱磷酶标记的抗地高辛抗体（1：500）37℃中孵育3h，PBS洗三次，每次5min
３、TSM1洗；
４、TSM2洗；
（九）显色：用TSM2将NBT/BCIP按2：1稀释进行显色；显微镜下掌握染色程度
（十）终止显色：用水终止
（十一） 脱水，透明，封固
１、85%乙醇脱水，2min
２、95%乙醇脱水5min
３、无水乙醇脱水15min
４、二甲苯20min
５、封片，镜检
