水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA
水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA | 时间: January-5 20:43:31 | 分类:技术栏目
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实验原理
闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA（cccDNA）、线性质粒DNA（L-DNA）和开环质粒DNA（ocDNA）。
实验材料和试剂
（一）实验样品
质粒pUC118
（二）试剂
1．l DNA/HindIII分子量标准
2．溴酚蓝指示剂点样缓冲液
0.2% 溴酚蓝
50% 蔗糖
3．1mg/ml溴化乙锭溶液
4．电泳缓冲液（TAE）
40 mmol/L Tris-乙酸
1 mol/L EDTA
(配制方法：24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml）
5．0.7% 琼脂糖凝胶
（配制方法：称取琼脂糖0.35克，加入50ml TAE电泳缓冲液）
（三）仪器
微量移液器 电泳仪
水平电泳槽 透射紫外观察仪
实验步骤
1．选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。检查稳压电源与正负极的线路。
2．选择孔径大小合适的点样梳子，垂直架在电泳胶模的一端，使点样梳子底部离电泳胶模底部的距离为1.0mm。
3．制备0.7%琼脂糖凝胶，100℃水浴加热至琼脂糖融化均匀。
4．用吸管取少量琼脂糖凝胶溶液将电泳胶模四周密封好，防止浇灌琼脂糖凝胶板时发生渗透。待琼脂糖凝胶冷却至60℃左右时，加入一滴溴化乙锭，摇匀，轻轻倒入电泳胶模中，琼脂糖凝胶的厚度在3～5mm。倒胶时要避免产生气泡，若有气泡可用吸管小心吸去。
5．琼脂糖凝胶凝固后，在室温放置20分钟，小心拔掉点样梳子和电泳胶模两端的挡板，保持点样孔的完好。
6．将电泳胶模放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，使电泳缓冲液面高出琼脂糖凝胶表面1～2mm。如点样孔内有气泡，用吸管小心吸出，以免影响加样。
7．将15ml DNA样品与1/5体积的溴酚蓝指示剂点样缓冲液混合。上样缓冲液不仅可以提高样品的密度，使样品均匀沉到样品孔内，还可以使样品带颜色，便于上样和估计电泳时间和判断电泳的位置。
8．用微量移液器将样品小心加入加样孔内，记录样品点样秩序。
9．盖上电泳槽，开启电源开关，较高电压不超过5V/cm（100～150V恒压电泳），使DNA从负极向正极移动。
10．电泳时间随实验的具体要求而异。电泳一般需1～3小时。电泳完毕后关闭电源，戴一次性塑料手套取出凝胶，尽可能将所有的电泳缓冲液淋干，在254nm波长的透射紫外灯下观察。
【提示】
（一）琼脂糖凝胶电泳
1．琼脂糖凝胶的性质
琼脂糖是从海藻中提取的一种直链多糖，它由D-半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖的残基交替排列组成的线型多聚糖。当琼脂糖加热至90～100℃左右，即可形成清亮透明的液体。浇在模板上冷却至40～45℃时，凝固形成凝胶。琼脂糖带有亲水性，不含有带电荷的基团，不引起DNA变性，又不吸附被分离的物质，因此它是一种很好的凝胶剂。琼脂糖凝胶可区分相差100bp的DNA片段。
2．DNA分子的迁移率
DNA分子在电泳中的迁移率的因素是多方面的，除了决定于DNA分子大小与构型外，还有琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液pH值和电泳时的温度等。
（二）实验操作中注意的问题
1．加热溶解琼脂糖时应不断地摇动容器，使附于壁上的颗粒也完全溶解。
2．溴化乙锭是一种强致癌剂，并有中度毒性，因此必须十分谨慎小心。操作时一定要戴手套，用过的手套要及时将手套顺手翻过来，让污染有溴化乙锭的面朝里。
3．用254nm波长的紫外光进行观察的效果比366nm清晰，但产生的切口DNA量也较高。紫外光对眼睛有害，观察时应戴上眼镜或防护面罩。
