四维核酸杂交技术介绍
四维核酸杂交技术介绍 | 时间: January-6 12:56:58 | 分类:技术栏目
凌仪生物专业提供高速离心机，美国Bio-rad伯乐电泳仪，德国eppendorf艾本德移液器，PCR基因扩增仪，雅培原位杂交仪，Thermo热电离心机等实验室仪器设备，要省钱，别错过哦。定义
四维核酸杂交技术[ 1 ]（4DH），即在传统核酸杂交三维空间(XYZ：表征DNA片段的长度、碱基组成和碱基的排列)的基础上引入温度作为第四位参数所构成的四维温度空间平台上建立的核酸杂交技术。
背景
基因组(genome)是指人类细胞中所有遗传信息的总和。基因组信息是由脱氧核糖核酸(又称为DNA)携带的。基因组的DNA是一种由4种碱基(A,G,C和T)组成的双链聚合体，这种双链结构的每条单链核苷酸链都以磷酸核糖为骨架，其碱基顺序称作DNA的一级序列结构。基因组DNA的两条链是通过每条链上互补碱基间氢键的相互作用而连结在一起的。碱基的化学结构显示，A与T相互作用形成两对氢键（而不与其他任何碱基作用），G与C相互作用形成三对氢键（而不与其他任何碱基作用）。DNA固有的内部双链以及碱基对相互作用的精确性在杂交过程中被利用。杂交是两条互补的单链核苷酸链之间形成一条稳定的双股螺旋双链结构的过程。杂交反应可以在溶液中两个互补单链之间发生，也可以一个溶液中的单链和固定在固相载体上的互补单链之间发生。而DNA芯片分析（或基因芯片分析）是利用了标有荧光的单股核苷酸链与DNA芯片上的单股序列链的杂交反应，是一种核酸杂交生物化学过程，这是DNA芯片（或基因芯片，也称DNA微阵列或基因微阵列）的原理基础，也是PCR技术中引物（寡核苷酸链）和样品靶（核苷酸单链）相互作用的基础。
基因芯片（或称DNA芯片）技术是基于碱基互补原理，在固体芯片表面（数平方厘米）按一定的排列组合阵列集成大量的DNA探针，通过与待测DNA（或基因）进行杂交反应，进而一次对大量DNA（或基因）进行平行快速分析检测的技术。
PCR技术是利用人工合成的引物（寡核苷酸链）在适当退火温度（或杂交温度）下与样品靶（核苷酸单股链）杂交后，由聚合酶在引物
由此可见，核酸的杂交反应（DNA单股之间称Southern杂交，DNA和RNA单股之间称Northern杂交）是核酸分子生物学和基因诊断技术的基础平台。
问题
传统的观念认为核酸的Southern或Northern杂交是特异性一对一碱基配对的，但是，事实上并不是如此较好的。当杂交温度有偏差时，错配一、二个碱基或简并能态的情况同样可以形成寡核苷酸杂交对。
开发PCR试剂盒都是用纯净单一序列的核酸链经优化过程而得出，当遇到包罗万象的临床样品时，由于提取的核酸往往是总核酸，其中只要有与引物探针是同源序列、近源序列（错一、二个碱基）或简并能态的部分，就有可能出非特异的假阳性信号。
基因芯片技术是继PCR技术之后又一个与基因相关的热门技术。基因芯片技术已经发展十几年，但是，一直无法上临床。为什么？用临床诊断检验员的话来说，再重复性不好。为什么不好？因为现有基因芯片技术采用的是传统杂交——即Southern杂交技术，即采用的是单一杂交温度（常用
正是由于传统杂交存在一定数量的假阳性信号，也造成在PCR的分析中存在一定数量假阳性信号，在应用传统杂交的DNA指纹鉴定中也同样存在一定数量的假阳性信号。这些缺陷都可以利用四维杂交技术（4DH）来克服。
解决方法
由于量子力学方程式无解析解，所以没有准确公式能够计算出DNA片段的熔点温度值（Tmp），近似估算值往往与实际值相差悬殊，实际应用中又必须知道准确值，才能确定较好杂交条件，所以许多厂家和公司开发产品时，不得不通过一个又一个优化实验来获得较优条件。四维杂交技术是在四维温度空间里来考虑基因芯片上各个DNA探针杂交温度不一致的问题，采用温度扫描的办法，测量比较各个点的特征熔点温度Tmp值，从而给出阴阳信号判定结果。这也就给出了大规模测定寡核苷酸片段熔点温度(Tmp)的简便方法，这无论是对科学研究人员，还是对诊断试剂厂家，都带来了极大的方便和效率。现在的基因诊断试剂都离不开探针和引物（PCR技术离不开引物，现有全自动基因测序仪离不开引物）——这都是寡核苷酸片段，其熔点温度(Tmp)对基因诊断试剂盒是致关重要的。
采用四维杂交技术，必须使用四维杂交反应试剂[ 2 ]。过去使用的PCR过程结束后立即进行温度扫描分析熔解曲线的方法，得出的特征熔点温度Tmp值，单管反应过程的再重复性不好。加入四维杂交反应试剂后，结果稳定，单管反应过程的再重复性非常好。而且可以让PCR的TaqMan探针模式结果做熔解曲线分析！排除掉假阳性信号。这是因为一般PCR商业试剂盒反应液是针对聚合酶的特异活性优化而来的较好反应条件，这个较好反应只是对聚合酶的扩增反应是较优化的，对核酸杂交反应不一定是较好反应条件！而四维杂交反应试剂是针对核酸杂交反应的特异性而进行较优化后得到的条件，更适合于核酸杂交反应。四维杂交反应试剂用于基因芯片分析，也可以很好解决传统杂交基因芯片有关再重复性不佳的问题。而依据相关专业设计出的四维基因芯片系统可以不用标记样品靶链，简化了样品处理，更适合临床使用。
传统三维杂交技术与创新四维杂交技术之间关系
如果将核酸杂交技术比喻成分子生物学的地基或平台，一点也不为过。如果在传统三维杂交技术平台上建筑分子生物学房子，就好象在沙滩上建房子，盖一层平房甚至二三层楼，可能都是不会有问题。但是，要盖分子生物学摩天大厦时就不能建立在沙滩这样的地基上（否则要瘫塌），而要建立在坚实的岩石地基上。四维杂交技术就是建筑分子生物学摩天大厦所需要的坚实岩石地基！传统三维杂交技术只是四维杂交技术的一个特例，但是，四维杂交技术的再重复性要远远优于传统三维杂交技术。这里指的再重复性是指不同时间之间的重复性、不同地点之间的重复性、不同操作者之间的重复性和不同种类反应之间的重复性，而不是单指同一时间、同一地点、同一操作者和同一种反应之间的可重复性，即此处指的再重复性是指客观规律的可重复性。这就是四维杂交技术的学术和商业价值！一项技术是否成熟，其结果的再重复性是一个极其重要标志。只有实际使用中结果的再重复性非常好，才能将高精尖的科技转化为工业生产和日常生活中可重复使用的生产力，造福于人类。
